本作的前半部份发生于《生化危机2》之前,女主角吉尔于洋馆事件后,一直调查有关安布雷拉公司的地下业务。当时美国联邦政府决定以核弹彻底毁灭浣熊市,吉尔于是展开她的逃亡之旅。在逃亡期间,她受到安布雷拉公司欧洲分部派来浣熊市的生物武器追击者(Nemesis)追杀,并且遇上了隶属于Umbrella Biohazard Countermeasure Service(UBCS)的男主角卡洛斯,以及UBCS成员Mikhail Victor、Nicholai Ginovaef。
吉尔及卡洛斯逃至市政府时,吉尔不幸受到追击者攻击而感染了T-病毒,于是卡洛斯便到安布雷拉公司旗下的附属医院寻找解药。
本作的后半部份发生于《生化危机2》之后,吉尔已经康复过来,于是继续出发逃命。此时美国联邦政府已经准备发射导弹实施“灭菌作战计划”,吉尔需要在15分钟内离开浣熊市。最后,在垃圾处理场成功击倒追击者,并且与卡洛斯乘坐直升机离开。